RNA extraction

TRNzol universal, 天根

EP管用Axygen的
枪头用拆封的, 不要用湿热灭菌的
75%乙醇是用100%乙醇和DEPC水配制

以下操作均在冰上进行

1. 移去原培养基, 每孔加1mL TRNzol, 用移液枪吹下所有细胞, 移到EP管中
2. 加200μL氯仿
3. 上下剧烈摇晃2min
4. 12000rpm, 15min, 4°C
5. 收集400μL上清到新EP管中
6. 加600μL异丙醇
7. 上下颠倒几次, 混匀即可
8. 4°C过夜
9. 12000rpm, 15min, 4°C
10. 倒掉上清, 再用移液枪移去上清
11. 加入1mL 75%乙醇, 上下颠倒至沉淀悬浮
12. 12000rpm, 7min, 4°C, 倒掉上清
13. 重复11和12三次
14. 彻底移去上清, 超净台中干燥30min, 最终呈淡黄透明, 无白色
15. 加入10μL预热的DEPC水, 60°C加热5min
16. 振荡离心后测RNA浓度(1μL)
17. 计算用量, 立即反转
    1. 全式金(10μL体系, R 2μL, E 0.5μL, RNA(500ng) V, DEPC 7.5-V)
    2. 全式金(20μL体系, R 4μL, E 1μL, RNA(1000ng) V, DEPC 15-V)
    3. 可以先将样品RNA浓度都稀释到一样
    4. 55°C 20min, 85°C 5min, 4°C ∞
18. cDNA保存于-20°C, 使用时稀释10倍用于做q-PCR