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lysates click reaction

细胞裂解​

裂解液:
雅酶RIPA裂解液(中强, PC102), 雅酶蛋白酶抑制剂, 碧云天核酸酶0.125 U/µl
PBS + 0.1% SDS, 补加雅酶蛋白酶抑制剂, 碧云天核酸酶0.125 U/µl

  1. 长满细胞的60mm dish
  2. 照或者不照365nm, 若照的话需要用冷的PBS覆盖, 置于冰上, 开盖暴露于365nm 5s
  3. 移去原有培养基或PBS, 加冷的PBS用细胞刮收集到1.5ml EP管中
  4. 离心, 1000g, 5min, 4°C
  5. 移去上清, 保存至-20°C, 或立即开始下一步
  6. 冰上解冻, 用100μl裂解液重悬
  7. 冰浴超声5次, 每次5s, 每次间隔10s
  8. 转移到冰上孵育20min
  9. BCA测定蛋白浓度

in-gel fluorescence​

10x click mix: 10mM TCEP, 10mM CuSO4, 1000μM TBTA, 200μM 488-azide

  1. 计算好30μg的裂解液, 不到45μl的用PBS补加到45μl
  2. 配置10x的click mix, 每管加5μl, 反应体系终浓度为1mM TCEP, 1mM CuSO4, 100μM TBTA, 20μM 488-azide
  3. 37°C反应1h
  4. 70°C加热10min
  5. 加loading buffer, 100°C加热5min
  6. 8%-20%预制胶, 180V, 55min
  7. MeOH/AcOH/H2O 5:1:4, 在此溶液中固定15min
  8. 最后水洗过夜