Isolation and Differentiation of Primary Adipose SVF cells

Reagents：

1. SVF media:
   To 500 mL bottle of DMEM/F12 add:
   55 mL of filtered FBS (Lot tested to support differentiation)
   5 mL of Pen/Strep
2. 100 um and 40 um cell strainer
3. Digestion buffer:
   For 10 mL:
   10 mL stock buffer
   10 mg Collagenase D (Roche) (1 mg/mL= final concentration)
   0.15 g of BSA (1.5%=final concentration)

Stock concentration	For 500 mL	Final Concentration
1 M HEPES	50 mL	100 mM HEPES pH 7.4
5 M NaCl	12 mL	120 mM NaCl
3 M KCL	8.3 mL	50 mM KCL
100 mM Glucose	25 mL	5 mM Glucose
2.5 M CaCl2	0.2 mL	1mM CaCl2
ddH20	404.5 mL

Stock solutions

Insulin: 5 mg/ml = 1000X

1. Make 1M HCl: 2.5ml 12M HCl + 27.5ml ddH2O
2. Make 50mM HCl: 2ml 1M HCl+ 38ml ddH2O
3. Dissolve 100mg of insulin (Sigma I6634) in 20ml of 50mM HCl.

IBMX: 250mM = 500X

Dissolve 832.5 mg of IBMX (Sigma I7018)
in 15ml of DMSO.

Dexamethasone: 1mM = 1000X

Dissolve 5.88mg of dexamethasone (Sigma D4902) in 15ml EtOH.

SVF isolation

1. 在1.5ml EP中加入200ul digestion buffer，取小鼠inguinal WAT，放到1.5ml EP管中，至于冰上。
2. 用眼科剪将iWAT剪碎，肉眼看不到大块脂肪组织。
3. 将剪碎后的脂肪组织转移到50ml离心管中，10块fat pad用25ml digestion buffer，37度水浴锅120速度，消化30min-40min，每隔10分钟拿出来剧烈颠倒混匀。
4. 消化完成，用100um 细胞筛过滤，加入30ml SVF media，600g离心5min。
5. 需要脂肪组织，取上面白色的一层；取SVF的话，将上面全部弃掉，留下下面的细胞沉淀。
6. 用10ml SVF media将细胞重悬，过40um细胞筛，600g离心5分钟。
7. 弃上清，将细胞重悬后铺板。
8. 经验来说，两个inguinal铺到一个100mm dish里, 每天换液的情况下，大约24x6小时长到80%
9. 等传代后的细胞长满以后，再过12个小时，加入诱导液，诱导48h。（诱导液配制： SVF media加入终浓度为5 ug/ml insulin+1uM Dexamethasone +0.5 mM isobutylmethylxanthine (IBMX) +1 uM Rosiglitazone）
10. 诱导48h后，换成maintain buffer（SVF media 中加入5 ug/ml insulin），每隔两天换一次maintain buffer，第6天细胞已经分化成为成熟的脂肪细胞。