BMDM isolation

取骨过程

准备 手术器械75%乙醇充分消毒
一个60mm dish, 其中加入75%乙醇

去除小鼠的腿部的皮, 暴露出腿部肌肉
基本上是在大小腿关节处环剪一圈
将小腿上的皮向脚的方向剥, 暴露出脚筋
剪断4根脚筋
将小腿处的肉往大腿方向剔, 不需要剔很干净
将大腿外部肌肉剪掉, 方便容易找到与腰椎的连接处
拽着脚, 转动整根腿, 同时用剪刀抵着大腿根部, 凭感觉找到大腿与腰椎的连接处, 剪断
转动关节, 分离脚和小腿和大腿
若腿骨断裂, 即无用
小腿比较脆弱, 仅用手指来剥除肌肉
大腿, 先抠住膝关节向大腿根部剥, 可一下剥除很多肌肉, 然后可用剪刀继续剔肉, 剪掉软骨
将干净的腿骨放到60mm dish中
直到获取足够的腿骨

经验来说, 5只小鼠的腿骨分得的BMDM可铺满4块6孔板

细胞铺板

准备 高温高压灭菌的镊子x2 高温高压灭菌的剪刀x1
20 mL 注射器x1
1 mL 注射器x1
1640培养基
M-CSF
红细胞裂解液
PBS

把60mm dish中的75%乙醇移除, 换成培养基
20 mL 注射器吸满1640培养基, 拆去针头, 换作1 mL 注射器的针头
用两个镊子继续给腿骨去肉去毛
干净后剪掉腿骨两端
将针头插入较小的一端, 将细胞冲至50 mL 离心管中, 注意下端要低于管口, 若剪口倾斜, 培养基易从侧面冲出
冲干净的腿骨应当呈白色透明, 若有红色残留, 大概率也是不需要的细胞, 可弃去
离心, 500 xg, 5 min, 弃去上清
红细胞裂解液用PBS配至1x, 重悬细胞, 吹打20次
5只小鼠分出的骨髓细胞可用5mL 裂解液, 作为参考
加入培养基终止裂解
100 μm 滤膜过滤
离心, 500 xg, 5 min, 弃去上清
用加入M-CSF的1640培养基重悬, 铺板

等待BMDM贴壁需要3天, 期间不用换液, 到第三天换液