siRNA transfection
试剂
- siRNA（公司一般会提供3种siRNA，1个通用阴性对照，1个FAM标记通用阴性对照，1个GAPDH阳性对照）
- 转染试剂为Lipo2000或Lipo3000
- Opti-MEM，或者简单化为无抗生素无血清培养基（特殊的，若转染BMDM的话，需补充20ng/mL的M-CSF）
环境
- siRNA长期放置最好以冻干粉形式保存，可保存1年以上。第一次溶解时先勿开盖，在1000g，4°C离心1min后，用DEPC水溶解至20pmol/μL（推荐值），分装保存，避免反复冻融，-20°C至-80°C可保存半年以上。
- siRNA最好冰上放置，整个实验过程，要求RNA酶free，枪头、EP管等都应该经过无酶处理。
转染前准备
- 至少3个平行重复
- 推荐转染使用的细胞密度为70%-80%
- 建议转染前12h更换细胞培养基为Opti-MEM
转染步骤
以下步骤以24孔板为例，所有用量和体积均按每孔给出。对于其他规格，请参见“扩大或缩小转染规模”。
- 稀释siRNA：在无菌管中加入50μL的Opti-MEM，再加入20pmol的siRNA低聚体，用移液枪轻轻混匀，室温静置5min。
- 稀释转染试剂：在另一无菌管中加入50μL的Opti-MEM，再加入1μL的Lipo2000，用移液枪轻轻混匀，室温静置5min。
- 将已稀释的Lipo2000加入到已稀释的siRNA低聚体中，用移液枪轻轻混匀，室温静置15min。（不能静置超过30min，最好15min后立即加入孔板）
- 将siRNA低聚体-Lipo2000复合物添加至孔板中，轻轻晃动细胞板至均匀分布。
- 根据后续实验需求在培养箱中孵育细胞24-96小时。24-48h检测mRNA表达（qRT-PCR），48-96h检测蛋白表达（Western Blot）。
- 可在6-8h更换为完全培养基，避免细胞长时间饥饿造成的细胞活力损失。
扩大或缩小转染规模
| Culture vessel | Surf. area per well1 | Vol. of plating medium | Vol. of dilution medium2 | RNA | Lipofectamine 2000 |
|---|---|---|---|---|---|
| 96-well | 0.3 cm 2 | 100 µl | 2 x 25 µl | 5 pmol | 0.25 µl |
| 24-well | 2 cm 2 | 500 µl | 2 x 50 µl | 20 pmol | 1.0 µl |
| 12-well | 4 cm 2 | 1 ml | 2 x 100 µl | 40 pmol | 2.0 µl |
| 6-well | 10 cm 2 | 2 ml | 2 x 250 µl | 100 pmol | 5 µl |
| 60-mm | 20 cm 2 | 5 ml | 2 x 0.5 ml | 200 pmol | 10 µl |
| 10-cm | 60 cm 2 | 15 ml | 2 x 1.5 ml | 600 pmol | 30 µl |
1 Surface areas may vary depending on the manufacturer.
2 Volumes of dilution medium in Step 2a & 2b of DNA or RNAi transfection protocols.