protein extraction

贴壁细胞

从贴壁细胞中提取

1. 雅酶RIPA裂解液(中强, PC102)
2. 蛋白酶抑制剂

以6孔板为例
移去上清, PBS清洗2遍, 250μL RIPA裂解液覆盖细胞, 置于冰上在摇床上摇晃15-20min, 用细胞刮收集细胞至1.5mL EP管中, 12000rpm, 4°C, 5min, 收集上清至新的1.5mL EP管中

从上清中提取

1. 收集1000μL细胞上清至1.5mL EP管中, 3000rpm, 4°C, 5min
2. 移动800μL上清至2mL EP管中, 加入800μL甲醇和200μL氯仿, 充分振荡30s, 13000rpm, 4°C, 5min
3. 小心移去上层(甲醇/水)和下层(氯仿), 不要过分吸上层, 可保留一些
4. 加入1000μL甲醇, 充分振荡30s, 13000rpm, 4°C, 10min
5. 移去上清, 晾干(有条件可以真空离心干燥), 但不宜过于干燥, 不易于复溶
6. 加入40μL 2x loading buffer(蛋白酶抑制剂+), 37°C振荡复溶蛋白, 难以复溶的话可加3%SDS
7. 100°C煮10min