BMDM isolation

取骨过程

准备 手术器械75%乙醇充分消毒
2个60mm dish, 一个加入75%乙醇, 一个加入PBS

去除小鼠的腿部的皮, 暴露出腿部肌肉
基本上是在大小腿关节处环剪一圈
将小腿上的皮向脚的方向剥, 暴露出脚筋
剪断4根脚筋
将小腿处的肉往大腿方向剔, 不需要剔很干净
将大腿外部肌肉剪掉, 方便容易找到与腰椎的连接处
拽着脚, 转动整根腿, 同时用剪刀抵着大腿根部, 凭感觉找到大腿与腰椎的连接处, 剪断
转动关节, 分离脚和小腿和大腿
若腿骨断裂, 即无用
小腿比较脆弱, 仅用手指来剥除肌肉
大腿, 先抠住膝关节向大腿根部剥, 可一下剥除很多肌肉, 然后可用剪刀继续剔肉, 剪掉软骨
将干净的腿骨放到75%乙醇中
2-5min后移至PBS中
直到获取足够的腿骨

经验来说, 1只6周的小鼠的腿骨分得的BMDM可铺4块6孔板/12孔板, 在24x3h换液后, 再过12h是70%的细胞密度

细胞铺板

准备 高温高压灭菌的镊子x2
高温高压灭菌的剪刀x1
20 mL 注射器x1
1 mL 注射器x1
1640培养基
M-CSF
红细胞裂解液
PBS

将腿骨移到新的含有PBS的60mm dish中
20 mL 注射器吸满1640培养基, 拆去针头, 换作1 mL 注射器的针头
剪掉腿骨两端
将针头插入较小的一端, 将细胞冲至50 mL 离心管中, 注意下端要低于管口, 若剪口倾斜, 培养基易从侧面冲出
冲干净的腿骨应当呈白色透明, 若有红色残留, 大概率也是不需要的细胞, 可弃去
离心, 600 xg, 5 min, 弃去上清
红细胞裂解液重悬细胞, 吹打20次, 静置2min
5只小鼠分出的骨髓细胞可用5mL 裂解液, 作为参考
加入培养基终止裂解
70 μm 滤膜过滤
离心, 600 xg, 5 min, 弃去上清
用加入M-CSF的1640培养基重悬, 铺板

等待BMDM贴壁需要3天, 期间不用换液, 到第三天换液